הקדמה:

• שיטת ה PCR מאפשרת לקחת מקטע DNA ספציפי ולשכפל אותו בצורה אקספוננציאלית, כדי לאפשר חקר מעמיק שלו. השיטה הומצאה ב-1983 על ידי קארי מוליס שזכה על כך בפרס נובל.

מרכיבי תגובת ה-PCR במבחנה (In vitro):

• בניגוד לשכפול בתא החי, במבחנה אין צורך באנזימים כמו הליקאז, פרימאז, טופואיזומראז או ליגאז.
• המרכיבים הנדרשים:
  • תבנית דנ"א
  • פריימרים
  • דנ"א פולימרז
  • בופר (המכיל Mg2+ ו-ATP)
  • נוקלאוטידים (dNTPs)
  • תמיסה מימית

שלבי מחזור ה-PCR:

• נשלטים על ידי מכשיר ה-Thermal Cycler. כל מחזור (Cycle) מכיל 3 שלבים בטמפרטורות משתנות:

1. דנטורציה - Denaturation:
   • חימום ל-94-96°C כדי להפריד את גדילי ה-DNA הכפול לגדילים בודדים.
2. היברידיזציה Annealing:
   • קירור הדרגתי ל-50-68°C כדי לאפשר לפריימרים להיקשר ספציפית לתבנית.
3. פולימריזציה Extension / Elongation:
   • העלאת הטמפרטורה ל-72°C. הדנ"א פולימראז מסנתז את הגדיל החדש מהפריימרים.

• חזרה על מעגל זה מובילה לגידול אקספוננציאלי.
• מקטע הדנ"א באורך הרצוי הופך לתוצר השכיח ביותר ככל שהמחזורים נמשכים.
• בדיקת תוצרי התגובה:
  • נעשית בדרך כלל על ידי ג'ל אלקטרופורזה שבו המולקולות רצות בהתאם לגודלן.

דנ"א פולימראז חסין חום (Taq Polymerase):

• בעבר היה צריך להוסיף פולימראז חדש בכל מחזור כי החום הגבוה של שלב הדנטורציה הרס את האנזים.
• כיום משתמשים בפולימראז הנקרא Taq polymerase שבודד מחיידקים שחיים בסביבות רותחות, ולכן הוא עמיד בחום (מוסיפים אותו רק פעם אחת בהתחלה).

אופטימיזציה של ה-PCR:

• ריכוז הדנא התבניתי וריכוז הפריימרים:
  • ריכוזים גבוהים יותר מובילים ליותר תוצר, אך מפחיתים את הספציפיות של התגובה.
• טמפרטורת ה-Annealing:
  • טמפרטורה גבוהה יותר מניבה קישור ספציפי יותר של הפריימר, אך טמפרטורה גבוהה מדי תמנע קישור בכלל.
  • יש למצוא את האיזון לכל סט פריימרים באמצעות גרדיאנט טמפרטורות.
• מספר מחזורים:
  • יותר מחזורים משמעותם יותר תוצר אך פחות ספציפיות.

בקרות ואמינות (False-positive and False-negative):

• בגלל שה-PCR מגביר בצורה מעריכית, חדירה של אפילו מולקולת DNA אחת כזיהום עלולה ליצור תוצאה חיובית שגויה (False-positive).
• לכן חובה להשתמש בבקרות:
  • בקרה שלילית (Negative control):
    • מבחנה עם כל המרכיבים אך ללא תבנית הדנ"א.
    • מוודאת שאין זיהום בראגנטים.
  • בקרה חיובית (Positive control):
    • מבחנה עם כל המרכיבים ודנ"א ידוע שאמור לעבוד בוודאות (כמו פלסמיד).
    • מוודאת שכלל חומרי הריאקציה פעילים.

אפליקציות ושיטות מתקדמות:

• שיטת qRT-PCR (Real-Time PCR):
  • שיטה כמותית המנטרת את הגברת הדנ"א תוך כדי התגובה (בזמן אמת) ולא רק בסופה.
  • מאפשרת הערכה כמותית מדויקת של הריכוז ההתחלתי, באמצעות צבעים פלואורסצנטיים או פרובים של דנ"א.
• שימושי ה-PCR:
  • בידוד מקטעי דנ"א ספציפיים (לדוגמה מהגנום כולו)
  • שיבוט דנ"א
  • חקר אבולוציה
  • ריצוף גנומי
  • חקר מחלות
  • תרפיה גנטית